Nizozemski raziskovalci združujejo CRISPR in bioluminiscenco v eksperimentalnem testu zanalezljive bolezni

Novo razvita nočna beljakovina bi lahko pospešila in poenostavila diagnozo virusnih bolezni, menijo raziskovalci na Nizozemskem.
Njihova študija, objavljena v sredo v ACS Publications, opisuje občutljivo enostopenjsko metodo za hitro analizo virusnih nukleinskih kislin in njihovega videza z uporabo svetlečih svetlo modrih ali zelenih beljakovin.
Identifikacija patogenov z odkrivanjem njihovih prstnih odtisov nukleinske kisline je ključna strategija v klinični diagnostiki, biomedicinskih raziskavah ter spremljanju varnosti hrane in okolja.Široko uporabljeni kvantitativni testi verižne reakcije s polimerazo (PCR) so zelo občutljivi, vendar zahtevajo sofisticirano pripravo vzorcev ali interpretacijo rezultatov, zaradi česar so nepraktični za nekatera zdravstvena okolja ali okolja z omejenimi viri.
Ta nizozemska skupina je rezultat sodelovanja med znanstveniki z univerz in bolnišnic pri razvoju hitre, prenosljive in za uporabo enostavne diagnostične metode nukleinske kisline, ki jo je mogoče uporabiti v različnih okoljih.
Navdihnili so jih utrinki kresnic, siji kresnic in drobne zvezde vodnega fitoplanktona, vse pa poganja pojav, imenovan bioluminiscenca.Ta učinek sveti v temi je posledica kemične reakcije, ki vključuje protein luciferazo.Znanstveniki so vključili proteine ​​luciferaze v senzorje, ki oddajajo svetlobo, da bi olajšali opazovanje, ko najdejo tarčo.Čeprav so zaradi tega ti senzorji idealni za zaznavanje na kraju samem, trenutno nimajo visoke občutljivosti, ki je potrebna za klinične diagnostične teste.Čeprav lahko metoda urejanja genov CRISPR zagotovi to zmožnost, zahteva veliko korakov in dodatno specializirano opremo za odkrivanje šibkega signala, ki je lahko prisoten v kompleksnih, hrupnih vzorcih.
Raziskovalci so našli način, kako združiti protein, povezan s CRISPR, z bioluminiscenčnim signalom, ki ga je mogoče zaznati s preprosto digitalno kamero.Da bi zagotovili dovolj vzorca RNK ali DNK za analizo, so raziskovalci izvedli rekombinazno polimerazno pomnoževanje (RPA), preprosto tehniko, ki deluje pri konstantni temperaturi okoli 100 °F.Razvili so novo platformo, imenovano Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), v kateri sta dva proteina CRISPR/Cas9 specifična za različne sosednje dele virusnega genoma, vsak z edinstvenim fragmentom luciferaze, pritrjenim zgoraj.
Ko je prisoten specifični virusni genom, ki ga raziskovalci preiskujejo, se dva proteina CRISPR/Cas9 vežeta na ciljno zaporedje nukleinske kisline;postanejo v neposredni bližini, kar omogoča, da nepoškodovani protein luciferaze nastane in oddaja modro svetlobo v prisotnosti kemičnega substrata..Da bi upoštevali substrat, porabljen v tem procesu, so raziskovalci uporabili kontrolno reakcijo, ki je oddajala zeleno svetlobo.Epruveta, ki spremeni barvo iz zelene v modro, pomeni pozitiven rezultat.
Raziskovalci so preizkusili svojo platformo z razvojem testa RPA-LUNAS, ki zaznavaSARS-CoV-2 RNAbrez dolgočasne izolacije RNA in dokazal svojo diagnostično učinkovitost na vzorcih nazofaringealnih brisov izCOVID 19bolniki.RPA-LUNAS je uspešno odkril SARS-CoV-2 v 20 minutah v vzorcih z virusno obremenitvijo RNA le 200 kopij/μL.
Raziskovalci verjamejo, da lahko njihov test zlahka in učinkovito zazna številne druge viruse."RPA-LUNAS je privlačen za testiranje nalezljivih bolezni na mestu oskrbe," so zapisali.